Епізоотологічні особливості грипу птахів в Україні

Епізоотологічні особливості грипу птахів в Україні

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АБРАМОВ АРТУР ВІКТОРОВИЧ

УДК 636.09.616.921.5:598.2:636.5

ЕпізоотологічнІ ОСОБЛИВОСТІ грипу птахів В УкраїнІ

16.00.08 - епізоотологія та інфекційні хвороби

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Державному вищому навчальному закладі „Державний агроекологічний університет” Міністерства аграрної політики України, м. Житомир

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, професор Галатюк Олександр Євстафійович, Державний вищий навчальний заклад „Державний агроекологічний університет”, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології;

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Скибіцький Володимир Гурійович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології;

доктор ветеринарних наук, професор Ткаченко Олексій Андрійович, Дніпропетровський державний аграрний університет, завідувач кафедри епізоотології та інфекційних хвороб.

Захист дисертації відбудеться “18” березня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ 41, вул. Героїв Оборони 15, навчальний корпус №3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ 41, вул. Героїв Оборони 13, навчальний корпус №4, кім. 28

Автореферат розісланий “12” лютого 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ______________ С.В. Міськевич

33

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Грип птахів реєструється більш ніж у 50 країнах світу та завдає значних економічних збитків (Swayne D., 2004; Покровский В.И. и др., 2005; Yegani M., 2005). У 2005-2006 роках епізоотичні вогнища захворювання птахів на грип виявлені на території Росії, Грузії, Азербайджану, Казахстану та України (Герман В.В. та ін., 2006; Луговская Н.Н. и др., 2006; Онищенко О.О. и др., 2006; Стегній Б.Т. та ін., 2006).

Проведення епізоотологічного моніторингу грипу птахів в Україні показало, що наявність антитіл до збудника грипу виявляється у різних видів птахів з вираженою тенденцією до підвищення титрів специфічних антитіл у птахів, що стаціонарно мешкають на територіях, через які пролягають шляхи міграції перелітних видів (Абрамов А.В., Герман В.В., 2006; Могилевський Л.Я. та ін., 2006).

Встановлено, що джерелом збудника інфекції є хворі та перехворілі птахи, які виділяють у навколишнє середовище віруси аерогенним шляхом, а також зі слиною, послідом, що створює передумови зараження їх через повітря, корми та воду. Так, екскременти водоплавних птахів-вірусоносіїв потрапляють до води річок та озер, а при подальшому її використанні для напування птахів та при харчуванні останніх водними тваринами може сформуватися водний шлях передачі вірусу грипу (Сюрин В.Н. та ін., 1998; Львов Д.К., 2000; Wright P.F., Webster R.G., 2001; Каверин Н.К., Смирнов Ю.А., 2003).

Відоме антигенне різноманіття збудника грипу, різний рівень патогенності циркулюючих у природі штамів, а також особливості патогенезу та прояву хвороби у тварин різних видів аргументують важливість і необхідність проведення відповідного епізоотологічного моніторингу, включаючи як наземні, так і водні осередки пташиного грипу, орієнтують на розробку та впровадження в практику ветеринарної медицини раціональних і ефективних методів визначення ступеня вірулентності штамів (ізолятів), які обумовлюють спалах хвороби.

У зв'язку з вищенаведеним, епізоотологічний моніторинг грипу птахів, зокрема вивчення особливостей збереження вірусу і його поширення у наземному та водному середовищах, наявність проміжних господарів (личинки комах, риби, земноводні) є вкрай необхідним, а розробка інтегральної системи контролю за спалахами хвороби на території України є нагальною потребою сьогодення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет” та у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини згідно з темою “Крайова епізоотологія, розробка методів діагностики та боротьби з інфекційними хворобами тварин”, номер державної реєстрації 0107U002473.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - визначити особливості циркуляції вірусу та формування природних наземних і водних осередків грипу птахів в України для удосконалення системи профілактичних та оздоровчих заходів.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

- здійснити епізоотологічне обстеження птахівничих господарств, деяких перелітних, синантропних та птахів приватного сектору на території України щодо пташиного грипу;

- виділити епізоотичні штами збудника високопатогенного пташиного грипу та провести їх молекулярно-генетичний аналіз;

- вивчити особливості циркуляції збудника та формування природних наземних і водних осередків грипу птахів у південному регіоні України;

- визначити морфофункціональні зміни у зародків курчат та риб, заражених вірусом грипу, який виділений з личинок комах - хірономід (мотиль);

- розробити ефективну електронну інтегральну систему контролю за спалахами пташиного грипу в Україні.

Об'єкт дослідження - грип птахів, збудник грипу птахів.

Предмет дослідження - епізоотична ситуація щодо грипу птахів в України, особливості перебігу хвороби, джерела збудника грипу, порівняльний молекулярно-генетичний аналіз епізоотичних ізолятів вірусу високопатогенного грипу, система контролю грипу птахів.

Методи дослідження. Епізоотологічні (епізоотологічне обстеження), клінічні (огляд і пальпація птахів, визначення маси, довжини та коефіцієнта вгодованості коропів), гематологічні (визначення кількості еритроцитів та лейкоцитів); патолого-анатомічні (патолого-анатомічний розтин), гістологічні (гістоструктура тканин курячих ембріонів), серологічні (дослідження в РГА, РЗГА та ІФА), вірусологічні (ізоляція, ідентифікація та культивування вірусів на культурі клітин), молекулярно-біологічні (ідентифікація та молекулярно-генетична оцінка вірусу в ПЛР), імунологічні (бактерицидна та лізоцимна активність сироватки крові), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчена епізоотична ситуація щодо поширення грипу птахів, обумовленого різними штамами вірусу грипу на території України. Встановлено, що на формування стаціонарних осередків неблагополуччя значно впливає видовий склад птахів, що мешкають на цій території. Високопатогенний вірус грипу виділено від птахів видів Phalacrocorax carbo, Anas platyrhynchos, Anser albifrons, Fulica atra, які мешкають у водних та біляводних біотопах. Птахи п'ятого виду (Turdus philomelos) надають перевагу сухій рівнинній місцевості, а для місць гніздування шостого виду (Sturnus vulgaris) не обов'язкова наявність великих водоймищ. Вперше встановлена циркуляція високопатогенного вірусу грипу H5N1 у птахів на території України і доведена відсутність мутацій з адаптації вірусу до рецепторів епітеліальних клітин верхніх дихальних шляхів людини, до яких вірус грипу є тропним. Визначені та нанесені на карти епізоотичного стану районів півдня України природні водні осередки, де від птахів були виділені штами вірусу H5N1 високопатогенного грипу птахів. Встановлено тривале виживання (протягом року) високопатогенного вірусу H5N1 в природному осередку неблагополуччя на південній косі узбережжя Азовського моря (патогенний вірус H5N1 виявлено у мотилі та бентосі). Експериментальними дослідженнями доведена тривала циркуляція вірусу пташиного грипу H5N1 в організмі холоднокровних (мотиль, п'явка, риба).

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень використані при розробці “Національної програми по ліквідації спалахів високопатогенного грипу птахів та хвороби Ньюкасла”. Створені карти поширення грипу птахів на території України, що збігаються із шляхами міграції перелітних птахів. Матеріали дисертаційної роботи використані при розробці “Інструкції по заходах боротьби з грипом птиці”, яка затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини України (наказ № 96 від 26.10.2005.) та Міністерством юстиції України (наказ № 1304/1158 від 31.10.2005). У Центральній державні лабораторії ветеринарної медицини впроваджено діагностику грипу птахів методами полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) при обов'язковій детекції продуктів ампліфікації в електрофорезному гелі та у реальному проміжку часу (ПЛР “реал-тайм”). При надгострому перебігу високопатогенного грипу, який супроводжується масовою загибеллю птахів, з діагностичною метою запропоновано, в першу чергу, застосовувати ПЛР та ПЛР “реал-тайм”.

Виділено високопатогенний штам вірусу грипу “A(chironomida)Azov/11/ 2006(H5N1)” та проведено його депонування в Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів (депозитарій №435).

Розроблена і впроваджена електронна інтегральна програма контролю за спалахами пташиного грипу в Україні, а також система профілактичних заходів при реєстрації спалахів пташиного грипу, яка рекомендована для виконання керівниками птахівничих та рибоводних господарств, а також мисливцями та рибалками.

За результатами досліджень отримано два патенти: “Біологічний засіб діагностики збудника паразитарної хвороби у людини або тварини” (патент України №13934 від 17.04.2006 р.) та “Спосіб контролю поширення захворювання пташиного грипу” (патент України №18122 від 16.10.2006 р.).

Одержані результати досліджень використовуються в навчальному процесі на кафедрах: мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет”; епізоотології та інфекційних хвороб Національного аграрного університету; епізоотології та інфекційних хвороб Білоцерківського державного аграрного університету. Матеріали дисертаційної роботи використовують на курсах підвищення кваліфікації фахівців ветеринарної медицини у вищевказаних університетах.

Особистий внесок здобувача полягає у самостійному плануванні та виконанні експериментальної частини роботи, зокрема організації і проведенні дослідів, відборі матеріалу, проведенні клінічних, серологічних, патолого-анатомічних досліджень. Частина досліджень (вірусологічні та молекулярно-біологічні) виконані спільно із співробітниками відділів вірусології, а також імунологічних та моніторингових досліджень Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини. Аналіз та узагальнення літературних джерел, первинних матеріалів, статистичну обробку та оформлення рукопису здобувач зробив самостійно. Гістологічні дослідження курячих ембріонів, заражених високопатогенним вірусом грипу “A(chironomida)Azov/ 11/2006(H5N1)”, виконані спільно з доцентом кафедри ветеринарно-санітарної експертизи та патологічної анатомії Білоцерківського державного аграрного університету, к.вет.н. І.В. Панченком.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були оприлюднені та проаналізовані на Міжнародних науково-практичних конференціях: “Високопатогенний грип птиці: актуальні аспекти епізоотології, епідеміології, діагностики та профілактики” (сел. Новий Світ, АР Крим, 2006 р.); “Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных болезней животных и птиц” (м. Самарканд, 2006 р.); “Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології” (м. Феодосія, 2007 р.); “Регіональні проблеми екології ветеринарної медицини”, присвяченій 20-річчю факультету ветеринарної медицини Державного вищого навчального закладу “ДАУ” (м. Житомир, 2007), та на науково-практичних конференціях: присвяченій 75-річчю Новогалещинської біофабрики (м. Полтава, 2006 р.); “Перспективи розвитку ветеринарної медицини України”, присвяченій 10-річчю факультету ветеринарної медицини Луганського НАУ (м. Луганськ, 2007 р.); щорічних звітних конференціях професорсько-викладацького складу факультету ветеринарної медицини Державного вищого навчального закладу “ДАУ” (2005-2007 рр.); засіданнях кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “ДАУ”.

Публікації. Результати досліджень, які представлені у дисертації, опубліковані у 10 друкованих працях: науково-виробничому щомісячнику Державного департаменту ветеринарної медицини “Ветеринарна медицина України” (2), у міжвідомчому тематичному науковому збірнику “Ветеринарна медицина” (2), “Віснику Білоцерківського державного аграрного університету” (1), “Віснику Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет” (1), “Збірнику наукових праць Луганського національного аграрного університету” (1), матеріалах Міжнародної конференції з пташиного грипу (1), патентах (2).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 211 сторінках комп'ютерного тексту (основний текст роботи - 136 с.) і складається зі вступу, огляду літератури, власних досліджень, їх аналізу та узагальнення, висновків і пропозицій для виробництва, 17 додатків, списку використаних джерел, який включає 290 найменувань, у тому числі 156 - іноземних; містить 16 таблиць, 19 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Вибір напрямків досліджень, матеріал та методи виконання роботи

Дослідження виконувались з 2003 по 2007 рік у науковій лабораторії кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет”, у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини, а також у референтних центрах з вивчення грипу птахів VLA (Вейбрідж, Англія), Федеральній державній установі “Федеральний центр охорони здоров'я тварин” (Володимир, Росія) і Федеральній державній установі “Центральний науково-дослідний інститут епідеміології” (Москва, Росія).

Епізоотологічний моніторинг грипу птахів проводився серед різних видів птахів у різних областях України та АР Крим. У 2003-2006 роках було досліджено на грип птахів 423098 проб. Згідно з рекомендаціями МЕБ діагноз на грип птахів встановлювали комплексно з врахуванням результатів епізоотологічних, клінічних, патолого-анатомічних та лабораторних (РГА, РЗГА, ПЛР та ІФА) методів досліджень. Для досліджень на грип відбирали свіжі трупи та хвору птицю у кількості не менше п'яти голів з кожної групи, підозрілої у захворюванні (Manual of diagnostic tests, 2004). Для вірусологічних досліджень відбирали проби змивів з глотки та клоаки, внутрішні органи (легені, трахею, селезінку, печінку, повітроносні мішки) та головний мозок. Для проведення ретроспективної діагностики відбирали не менше 25 проб сироваток крові від однієї групи птахів.

Проби змивів доставляли до лабораторії для проведення вірусологічних (ізоляція вірусу на курячих ембріонах з наступною ідентифікацією) та молекулярно-генетичних досліджень. Для деконтамінації змивів до середовища 199, в якому їх транспортували, додавали антибіотики (4 %-й розчин гентаміцину сульфату, 1000 мкг/см3). Для транспортування проби (змиви, шматочки внутрішніх органів) спочатку охолоджували до +4 єС, а потім заморожували в морозильнику до -20 єС, після чого в термосах з сухим льодом доставляли до лабораторії. Для ізоляції та типізації вірусу грипу із відібраних проб органів та тканин ураженої птиці готували гомогенати 1:10 на 0,9 %-му розчині NaCl або фосфатному буфері (рН 7,2-7,4) з додаванням пеніциліну та стрептоміцину. Одержані гомогенати звільняли від часток тканин центрифугуванням та використовували для зараження курячих ембріонів (Сюрин В.Н. та ін., 1998).

Зразками вірусовмістимої рідини заражали 10-добових курячих ембріонів, з розрахунку не менше 5 ембріонів на одну пробу. Зараження проводили в алантоїсну порожнину. Інфіковані ембріони інкубували при +41 єС упродовж 3-5 діб. У разі наявності вірусу в пробі, загибель наставала через 48-72 години після зараження. Ембріони, що загинули, розтинали, описували наявні ознаки пошкоджуючої дії патогена та відбирали алантоїсну рідину для подальшого дослідження в РГА. Після закінчення терміну інкубації, навіть за відсутності випадків загибелі, ембріони розтинали, відбирали алантоїсну рідину, гемаглютинуючу активність якої визначали у реакції гемаглютинації з 1%-ю суспензією еритроцитів півня. У разі відсутності позитивної реакції в РГА додатково проводили 3?5 “сліпих” пасажів.

З матеріалу, відібраного в місцях скупчення диких птахів у системіоз. Сиваш, проводили ізоляцію, остаточну ідентифікацію та молекулярно-генетичну оцінку вірусу пташиного грипу. Матеріалом для досліджень були проби (по 5 зразків кожного об'єкта) ? пеленгас (Mugil soiuy), креветка (родина Сrangon), личинка комах (родина Chironomida - мотиль) та мул, що відібрані в різних ділянках північно-західної акваторії Азовського моря (оз. Сиваш - Кризамі, Костін Шпиль та Любимівка). Геномну РНК для ПЛР-аналізу виділяли гуанідін тіоціонатним методом (Chomczynski P. and Sacchi N., 1989).

Аналіз проводили за допомогою діагностичної тест-системи “Птах-Грип-ПЛР-РЧ” для виявлення РНК вірусу пташиного грипу А/H5N1 методом полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу, ТУ 24.4-23524007-064-2006, серія 001/AIV/RG-100, згідно з настановою з використання діагностичного набору. Кожен зразок досліджували у двох повторах. Ампліфікацію у реальному часі проводили в реактивній суміші об'ємом
25 мкл. Ампліфікацію кДНК мішені здійснювали на приладі Rotor-Gene 3000, Corbett research (Австралія), з таким температурним профілем: активація урацил-ДНК-глікозидази - 5 хв при +50 °С, активація ДНК-полімерази - 10 хв при +94 °С та наступні 40 циклів ампліфікації, які включали денатурацію - 30 с при +94 °С, відпал праймерів - 30 с при +58 °С, елонгацію - 30 с при +72 °С. Аналіз результатів здійснювали за допомогою програмного забезпечення RG operating software, version 6.0.33.

Визначення нуклеотидної послідовності продуктів ампліфікації вірусу пташиного грипу проводили на генетичному аналізаторі ABI 3130 (Applied Biosystems) із використанням набору реагентів “BigDye®terminator, v.3,1”, згідно з інструкціями виробника. ПЛР-продукти клонували у бактеріальний вектор pBluescript II SK+(Stratagene) за загальноприйнятими методами генної інженерії (Sambrook J. et al., 1989). Визначення нуклеотидної послідовності продуктів ампліфікації вірусу пташиного грипу проводили на генетичному аналізаторі ABI 3130 (Applied Biosystems) із використанням набору реагентів “BigDye®terminator, v.3.1”, згідно з інструкціями виробника. Комп'ютерний аналіз даних проводили з використанням пакета програм Vector NTA v. 9.1 (Invitrogen) та Інтернет-ресурсів: BLAST, ClustalW, WebPhylip.

У частині дослідів вивчали морфофункціональні зміни у риб при експериментальному заражені ізолятом “A(chironomida) Azov/11/2006(H5N1)” вірусу грипу птахів. Зараження однорічок коропа (Carpio carpio) здійснювали через ін'єкцію в черевну порожнину вірусовмістимої алантоїсної рідини курячих ембріонів та матеріалу, одержаного із мотиля з титрами в РЗГА 1:64 та в РГА 1:256. Однорічним коропам двох експериментально заражених груп (в кожній по 15 риб) уводили внутрішньочеревно 0,1 та 0,2 см3 ізоляту “A(chironomida)Azov/11/ 2006(H5N1)” вірусу грипу птахів, а одній контрольній групі (15 риб) вводили розчин Рінгера. Риб витримували в окремих 10-літрових акваріумах з постійною аерацією та температурою +20±1 єС. З початку досліду кожні 24 години протягом перших 3 діб відбирали з кожної групи по 3 екземпляри, в яких брали кров із серця. Інших коропів досліджували на 5 та 10 добу. З тулуба коропів готували гомогенати, які зберігали при температурі +8±2 єС. З крові одержували сироватку, в якій визначали вміст білка (Loury et al., 1951), білкові фракції (альбумін, глобулін) турбодемитричним методом та активність лізоциму дифузним методом на агарі (Лабінська А.С., 1978). У коропів дослідних та контрольної груп визначали масу, довжину, коефіцієнт вгодованості за Фультоном, абсолютну (мг) та відносну (індекс ‰) масу імунокомпетентних органів (гепатопанкреас, нирка та селезінка). З імунокомпетентних органів виготовляли екстракти тканин (1:50), в яких визначали вміст водорозчинного білка та активного лізоциму. Проводили підрахунок кількості еритроцитів та лейкоцитів у десяти полях зору мікроскопа (при збільшенні ? 60Ч7) з одного мазка крові риб та визначали співвідношення кількості лейкоцитів (Л) до кількості еритроцитів (Е) у полі зору ? Е/Л (Кушманова О.Д., Івченко Г.М., 1978; Строев Е.А., Макарова П.П., 1986). Через 10 діб у риб дослідної та контрольної груп визначали лізоцим та бактерицидну активність сироватки крові (БАСК) (Смирнова А.В., Кузьмина Г.А., 1966).

В експерименті з вивчення п'явки як можливого компоненту резервуара збудника використали 30 медичних п'явок (Hirudo medicinalis). Зараження проводили алантоїсною рідиною з інфікованих штамом “A(chironomida) Azov/11/2006(H5N1)” 10-добових курячих ембріонів. Було сформовано 8 дослідних та 2 контрольні групи п'явок (по 3 екземпляри в кожній). Восьми дослідним групам п'явок внутрішньоцеломно вводили алантоїсну рідину, що містила вірус пташиного грипу в кількості 108,45 ЕЛД50/0,1см3 , 107,45 ЕЛД50/0,1см3, 106,45 ЕЛД50/0,1см3 і 105,45 ЕЛД50/0,1см3 відповідно. П'явкам контрольної групи вводили стерильний 0,9 %-й розчин NaCl. Доза введення 0,125 см3. П'явок утримували у флаконах з водою об'ємом 400 см3, закритих гумовими пробками з отворами. Через 5 та 45 діб після початку експерименту п'явок заморожували, потім розморожували і готували суспензію на стерильному фізіологічному розчині та досліджували методом ПЛР на наявність РНК вірусу пташиного грипу.

Статистичну обробку результатів проводили за загальноприйнятою методикою (Плохинський М.А., 1980), використовуючи комп'ютерну програму Microsoft Office EXCEL.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Страницы: 1, 2, 3