Биотехнология на страже урожая

Для производства инсектицидных препаратов применяются не только виды энтомопатогенных бактерий, изъятые из природы, но и микроорганизмы, созданные методами генетической инжене-рии. Ученые, сотрудничающие с компанией «Сельскохозяйствен-ные продукты Монсанто» (США), разрабатывают проблему клонирования гена, контролирующего синтез токсичных для насе-комых веществ и передачи этого гена бактерии Pseudomonas fluorescens -- безвредному неспороносному флуоресцирующему микроорганизму, который широко встречается в почве, воде, на различных растительных и животных субстратах. Созданные методами генетической инженерии энтомопатогенные бактерии можно использовать путем заражения ими семян или почвы во время посева. В этом случае инфекция может оказаться действен-ной в течение длительного времени. Ведь микроорганизмы, созданные методами генетической инженерии, даже в случае гибели вредных насекомых будут сохраняться в природной среде как обычные сапрофиты.

Проведенные исследования показывают, что клонирование токсичных генов возможно. Микроорганизмы, созданные методами генетической инженерии, оказались способными поражать опре-деленные виды вредителей растений.

В 1835 г. итальянский исследователь А. Басси впервые описал гриб из рода боверия, обнаруженный на гусеницах тутового шелкопряда. Гриб получил видовое название, образованное от фамилии первооткрывателя -- боверия бассиана (Beauveria bassiana). Гусеницы тутового шелкопряда, пораженные этим грибом, были сморщенными, сухими, покрытыми белым налетом, что делало их похожими на засахаренные фрукты. По этой причине заболевание тутового шелкопряда получило название белая мускардина (от французского слова, означающего «засахаренный фрукт»). Позднее было обнаружено, что гриб поражает не только полезных насекомых, к числу которых относится тутовый шелко-пряд, но и многочисленных вредителей (колорадский жук, картофельная коровка, луговой и кукурузный мотылек, сосновая пяденица, сосновая совка, вредная черепашка, яблонная и персиковая плодожорка, некоторые виды клещей). Боверия бассиана распространена очень широко. Она встречается всюду, где имеются насекомые, и поэтому по праву считается космополи-том. Только в Северной Америке ею поражается свыше 175 видов насекомых. В нашей стране возбудитель белой мускардины вызывает заболевание более 60 видов насекомых. Насекомые и клещи, устойчивые к белой мускардине, способствуют распростра-нению ее мицелия и спор. Другой представитель рода боверия -- боверия тонкая (Б. tonella) поражает главным образом вредных жуков: западного и восточного майских хрущей.

Мускардиновые грибы способны к сапротрофному питанию и сравнительно легко культивируются на искусственных питатель-ных средах. Правда, боверия тонкая несколько хуже растет в искусственных условиях, она требует присутствия в питательной среде витаминов. Боверия бассиана успешно размножается на ломтиках картофеля. Результаты сравнительного испытания гриба боверия бассиана в глубинной и поверхностной культурах показали, что в поверхностной культуре для его роста создаются более благоприятные условия. Состав питательной среды оказы-вает влияние на вирулентность гриба.

Еще в 60-х годах в Украинском институте защиты растений был изготовлен препарат боверин, представляющий собой порошок серого цвета, содержащий споры мускардиновых грибов В. bassiana и В. globalifera, а также наполнитель (каолин). Препарат был рекомендован в сочетании с сублетальными до-зами ядохимикатов для борьбы с колорадским жуком, дубовой листоверткой и другими вредителями сельского и лесного хозяй-ства.

В настоящее время для борьбы с вредными насекомыми привлекаются и другие виды грибов, в частности из родов метарризиум, вертициллиум, гирзутелла, гименостильбе, ашерсония, кониотириум, энтомофтора и др.

Важное место в арсенале средств борьбы с вредителями занимают биологически активные вещества насекомых. К числу таких веществ относятся феромоны, ювенильный гормон, гормон линьки.

Феромоны представляют собой биологически активные веще-ства, выделяемые животными в окружающую среду и специфи-чески влияющие на метаболизм, поведение, физиологическое и эмоциональное состояние других особей того же вида. Как правило, феромоны продуцируются специализированными железами животных. По характеру действия различают агрегационные феромоны (феромоны скучивания), феромоны, вызываю-щие реакцию тревоги или обороны, следовые феромоны, отмечающие путь следования насекомого в поисках пищи, феромоны-социального опознавания и регулирования, половые феромоны. Наиболее подробно изучены половые феромоны насекомыхкоторые обеспечивают встречу и узнавание особей разного пола и стимулируют половое поведение. Феромоиы, привлекающие особей противоположного пола, называют аттрактактами.

В 1959г. западногерманский биохимик Адольф Бутенандт установил строение полового аттрактанта самки тутового шелкопряда. Этот феромон был назван бомбиколом. Он вызывает, у самцов поведенческую реакцию при концентрации всего около, 1012 мг/л воздуха. К 1980г. феромоны были обнаружены y 700 видов насекомых, причем у 220 видов установлено химиче-ское строение. По химической природе феромоны не являются представителями какого-то определенного класса химических соединений. Половые феромоны самок чешуекрылых обычно относятся к предельным спиртам, ацетатам и альдегидам с 10--18 атомами углерода. Они могут быть представлены отдельными химическими соединениями, но чаще биологическое действие оказывает совокупность нескольких компонентов. Как правило, для биологического действия феромонов характерна видовая специфичность: разные виды насекомых используют в качестве феромонов определенные химические вещества или смеси с опре-деленным сочетанием компонентов.

В связи с открытием феромонов возникла мысль использовать их для борьбы с вредными насекомыми. Производство аттрактантов из желез насекомых малоэффективно из-за высокой трудоем-кости и низкого выхода продукта. В связи с этим были предпри-няты усилия по химическому синтезу этих веществ. К сожалению, химические феромоны оказались недостаточно специфичными, поскольку природные феромоны у многих насекомых представляют собой смесь индивидуальных химических веществ, причем некоторые компоненты ряда феромонов являются общими для нескольких видов. Синтез высокоспецифических феромонов за-труднен необходимостью получения химически чистых веществ и комбинаций их в определенном соотношении, отсутствием сведений о роли отдельных составляющих в управлении поведе-нием насекомых при спаривании. Известно, что у восточной плодожорки спаривание протекает в четыре этапа: привлечение самца к самке, приближение его, ориентация самки, копуляция. Каждый этап характеризуется действием определенного химиче-ского компонента.

В связи с недостаточной эффективностью синтетических феромонов важно отметить роль растений в образовании природ-ных аттрактантов. Так, например, в состав агрегационного феромона жука большого ильмового заболонника -- переносчика голландской болезни вязов, входит ?-кубебен, являющийся метаболитом дерева-хозяина. В состав феромонного комплекса жука-лубоеда входит мирцен, также образуемый растениями. Насекрмые могут использовать некоторые алкалоиды растений в качестве предшественников при синтезе половых феромонов. Содержащееся в растениях-хозяевах вещество ?-пинен служит исходным соединением для биосинтеза цис-вербенола жуками Ips paraconfusus. Интересно в связи с этим отметить, что превращение ? -пинена в вербенол осуществляет штамм бактерий В. cereus, выделенный из пищеварительного тракта этих жуков. Синтез предшественников феромонов клетками растений, превра-щение этих предшественников в феромоны насекомых при участии бактерий свидетельствует о том, что для практических целей могут быть использованы феромоны, полученные не химическим, а биотехнологическим путем использование методов биотехнологии, у в частности метода культуры тканей растений, а также приемов генетической инженерии, может оказаться весьма перспективным при организации производства высокоэффективных феромонов. Существуют три основных пути использования феромонов для борьбы с вредными насекомыми:

обнаружение видов насекомых;

массовый отлов насекомых;

нарушение системы ориентации по запаху, служащей для пространственного объединения особей разного пола.

Одним из важнейших путей практического применения естест-венных и химических феромонов для борьбы с вредными насеко-мыми является мониторинг состояния популяции, учет численности вредителей с помощью ловушек. Визуальные наблюдения за по-севами отнюдь не всегда позволяют выявить присутствие вреди-телей или установить истинную картину зараженности посевов. Попавшие в ловушки отдельные насекомые свидетельствуют о присутствии определенных видов на ближайшей территории, а количество пойманных насекомых позволяет судить о необходи-мости принятия мер по подавлению. Благодаря таким обследова-ниям удается резко сократить расход инсектицидов на борьбу с вредителями, предотвращать распространение насекомых на незаселенной территории.

Широкие возможности открывает применение ловушек с феро-монами для обнаружения карантинных вредителей. В настоящее время феромоны широко используются для раннего обнаружения объектов карантина (восточная плодожорка, карто-фельная моль, американская белая бабочка, средиземноморская плодовая муха, калифорнийская щитовка и др.). В 1976 г. специалисты из Министерства сельского хозяйства США раз-местили почти 17 тыс. ловушек с феромонами тримедлюром, кьюлюром и метилевгенолом на юге страны с целью фиксирования трех опасных вредителей: средиземноморской плодовой мухи, дынной мухи и восточной фруктовой" мухи. Они позволяют быстро обнаружить и уничтожить вредителей, прежде чем те успевают обосноваться на новой территории. Такое раннее выявле-ние вредителей сберегает многие миллионы долларов, которые потребовалось бы истратить на истребление опасных интродуцентов. Для той же цели кольцом ловушек были окружены порты, через которые осуществляется импорт товаров. Если какому-то вредному насекомому все же удается обосноваться, ловушки с феромонами облегчают истребление насекомых, точно указывая местонахождение вредителя, а также, где и когда следует при-менять химические инсектициды, которые в. этом случае не загряз-няют природную среду бесполезно. Так, например, в 1956 г. во Флориде средиземноморская плодовая муха распространилась на площади около 0,4 млн. га. Использование ловушек с аттрактантами для обнаружения местонахождения вредителя и инсектици-дов для его уничтожения позволило полностью истребить средиземноморскую плодовую муху до конца следующего года.

Американский хлопковый долгоносик, распространенный от восточного Техаса до Атлантического океана, -- один из самых опасных вредителей хлопчатника. На его долю приходится три четверти потерь хлопчатника и почти треть инсектицидов, ежегодно используемых в сельском хозяйстве США. В 70-х годах в некоторых штатах США была осуществлена программа подавления популяции хлопкового долгоносика с помощью сексоловушек с грандлуром.

На о-ве Рота, расположенном в Тихом океане, восточную фруктовую муху удалось искоренить путем приманивания самцов с помощью аттрактанта метилевгенола на поверхность, покрытую инсектицидом.

Таких примеров эффективного применения сексоловушек можно привести немало. Наряду с сексоловушками для создания «самцового вакуума» применяется рассеивание феромона. В этом случае происходит дезориентация самцов. Эффективность этого приема повышается по мере снижения численности популяции вредителя-мишени. При большой плотности популяции самцы могут находить самок случайно. Для дезориентации самцов непар-ного шелкопряда -- опасного вредителя лесных, декоративных и фруктовых деревьев -- используют препарат диспарлюр. Он сохраняет свою активность в полевых условиях в течение продол-жительного времени. В дозе 20 г/га диспарлюр существенно подавляет численность непарного шелкопряда. Это вещество не оказывает ощутимого воздействия на окружающую среду или другие любые организмы, кроме вредителя.

Применение феромонов позволяет не только дезориентировать насекомых и благодаря этому снижать численность вредителей, но и предотвращать расселение их из очагов заражения. Экспери-менты, проведенные в Пермской области, показали, что внесение феромона непосредственно в уже имеющиеся очаги высокой численности короеда-гипографа прекращает разлет жуков из этих очагов в другие места.

Первый отечественный феромон восточной плодожорки был синтезирован в середине 70-х годов. В 1975--1980 гг. в нашей стране были проведены испытания ловушек и феромонов отечест-венного и американского производства. Оказалось, что улавли-вающая способность ловушек, изготовленных в нашей стране, в 2 раза выше американских.

Расчеты ученых показывают, что для подавления популяции вредителя при высокой ее исходной численности требуется около 4,5 тыс. ловушек на 1 га или 50 -- на одно дерево. Но при неболь-шой численности для защиты сада достаточно использовать 30--50 ловушек на 1га.

Для развития нового направления борьбы с вредителями полей и садов необходимо создать высокоэффективные препара-тивные формы феромонов. Стоимость феромонов высока, поэтому учёные разработали такие методы их использования, когда испарение действующего вещества происходит медленно, в течение длительного времени. Так, например, для борьбы с непарным шелкопрядом применяются микрокапсулы, содержащие диспар-люр -- половой аттрактант этого насекомого. Он широко исполь-зуется в США в качестве средства прямой борьбы с этим чрезвы-чайно опасным вредителем. Диспарлюр вызывает дезориентацию самцов, которые становятся половозрелыми раньше, чем самки. Микрокапсулы аттрактанта представляют соббй шарики из желатина или полиамида диаметром от 3 до 40 мкм, внутри которых заключен медленно испаряющийся феромон. С помощью таких микрокапсул удается снизить численность непарного шелко-пряда за четыре недели на 98 %.

Ученые интенсивно работают над совершенствованием поли-мерных диспенсеров (носителей) и способов их разбрасывания. В США используются два типа диспенсеров -- фиброволокна фирмы Конрел и трехслойные полимерные пластинки фирмы Геркон. Норма расхода феромона обычно составляет несколько граммов на 1 га в течение сезона. По мнению специалистов, в ближайшие годы феромоны будут широко использоваться для борьбы с вредителями плодовых культур, хлопчатника, кукурузы и некоторых технических культур. Применение физиологически активных веществ для борьбы с вредными насекомыми представ-ляется чрезвычайно перспективным.

Наряду с феромонами в целях защиты растений могут быть использованы другие физиологически активные вещества насеко-мых. Железы внутренней секреции продуцируют различные гор-моны. Наиболее изученными являются ювенильный (или личиноч-ный) гормон и гормон линьки (экдизон). Они играют важную роль в гормональной регуляции развития насекомых. Вместе с тем специалисты в области защиты растения могут использовать эти гормоны для нарушения нормального хода развития и размноже-ния насекомых.

Использование гормональных препаратов для борьбы с вред-ными насекомыми имеет специфические особенности. Применение их не обеспечивает моментальную гибель насекомых, поэтому вредители в случае массового распространения могут нанести растениям существенный вред. Кроме того, критический период действия гормонов ограничен во времени, что также затрудняет их использование. Однако определенные преимущества гормональ-ных препаратов (они не накапливаются в организме, мало-токсичны для позвоночных животных, к ним невозможно привыка-ние насекомых) побуждают ученых вести дальнейшие исследования в направлении практического использования этих веществ в борьбе с вредными насекомыми. Эти исследования окажутся еще более продуктивными, если будут" проводиться с использованием методов биотехнологии и генетической инженерии. Установлено, что вещества, аналогичные гормонам насекомых, продуцируются рядом растений. Эти вещества, например, фитозкдизоны, могут производиться в ферментерах методом культуры растительных тканей.

Важный аспект защиты растений -- борьба с сорной раститель-ностью. В настоящее время для борьбы с сорной растительностью широко применяется химический метод, основанный на использо-вании гербицидов. Повсеместное использование гербицидов в со-временном растениеводстве обусловлено тем, что это рентабельный способ повышения урожайности сельскохозяйственных культур, высокоэффективный метод повышения производительности труда в сельском хозяйстве. Существенным недостатком гербицидов является их более или менее выраженная токсичность для животных и человека. Вместе с ливневыми водами, а также в результате сноса аэрозолей они могут попадать в водоемы, отравляя там все живое, делая воду непригодной для потребления животными и человеком. Кроме того, они могут накапливаться в растительных кормах и животноводческих продуктах.

В связи с этим ученые интенсивно работают над повышением, роли так называемого биологического метода борьбы с сорной растительностью, включающего использование для этой цели живых организмов или продуктов их жизнедеятельности. И здесь открывается широкое поле для применения достижений биотехно-логии генетической инженерии. С помощью биотехнологических приемов можно быстро размножить организмы, уничтожающие сорные растения, производить пригодные для той же цели веще-ства.

К настоящему времени получены гербициды нового поколения, более перспективные как с точки зрения эффективности, так и с позиций экотоксикологии. Их получают, в частности, из микро-организмов. Одно из преимуществ производства микробных гербицидов -- универсальность оборудования (ферментеров), необходимых для культивирования гербицидсинтезирующих микроорганизмов. Второе существенное преимущество микро-биологического производства пестицидов -- значительно меньшее отрицательное воздействие посредством отходов и выбросов на окружающую среду. В-третьих, гербициды микробного проис-хождения, не являются чужеродными для природной среды. Актиномицеты, обитающие в почве, постоянно вырабатывают их и выделяют в окружающую среду. Вполне естественно, в почвен-ном биоценозе в ходе эволюции возникли системы, направленные на деградацию веществ, выделяемых актиномицетами. Эти системы будут функционировать и в том случае, если мы обрабо-таем растения гербицидами, полученными при участии актиномицетов в ферментере. Благодаря этому в природной среде не будет происходить накопления токсичных веществ. Кстати, это обстоя-тельство должно учитываться при разработке методов использова-ния микробных гербицидов: многие из них будут обладать низкой эффективностью при внесении в почву.

В настоящее время известен ряд микроорганизмов, которые уже являются или могут быть значимыми продуцентами гербици-дов. Их использование в практике предполагает проведение более глубоких исследований в области главным образом генетической инженерии, что обеспечит интенсивное использование микроорга-низмов в многотоннажных биотехнологических производствах.

В Японии для борьбы с сорной растительностью предполагается использовать гербицид биалафос, продуцируемый актиномицетами Streptomyces hygrosporicus и S. viridochromogenes. Этот гербицид обладает широким спектром действия на такие сорняки, как ежовник обыкновенный, марь белая, сыть круглая при послевсходовом его применении на всуех фазах роста растений. При внесении в почву биалафос практически неэффективен по причине, указан-ной выше. После опрыскивания растений раствором гербицид быстро, перемещается в корни, затем растение гибнет. В этом отношении биалафос сходен с гербицидом глифосатом (фосфоно-метилглй1дином), однако его действие на сорные растения прояв-ляется более сильно. Рекомендуемая доза составляет 1 кг/га. В настоящее время в Японии налаживается, производство этого препарата. Предполагается, что он найдет широкое применение. Ученые не без оснований считают его чрезвычайно перспективным с точки зрения механизма действия. Он, очевидно, окажется в поле зрения физиологов растений, биохимиков, специалистов в области генетической инженерии.

Некоторые штаммы актиномицетов продуцируют вещество, называемое анисомицином, которое характеризуется тем, что замедляет рост корешков у проростков таких растений, как ежовник, люцерна, томаты, пальчатка и др. Это вещество стало исходным в получении целого ряда производных. Результатом исследования структуры и биологической активности этих произ-водных явилось создание нового гербицида под названием «метоксифенон». Это вещество обладает высокой эффективностью против многих однолетних видов сорняков. Применяют его перед появлением всходов. Появляющиеся всходы поглощают гербицид, в результате чего возникает хлороз, приводящий к отмиранию сорняков. Гербицид предназначен для использования в посевах риса.

Первоначально в фильтрате S. saganonensis 4075 были обнару-жены два метаболита с гербицидной активностью, так называемые гербицидины А и В, а позднее еще три -- С, Д, Е. Они оказывают избирательное контактное гербицидное действие на двудольные сорняки, подавляют прорастание семян. Вопрос об их практиче-ском использовании пока не решен.

Известны и другие гербицидоподобные вещества микроорганизмов, такие; как нарамицин, тойокамицин, пиолютерион, цитобарицин, формицин А и В. Перспективными продуцентами гербицидоподобных веществ рас-сматриваются S. toyocaensis, гриб ирпекс (Irpex pacyodon). Как эффективный гербицид действует ризобитоксин в дозе 0,2 кг/га, синтезируемый некоторыми штаммами Rhizobium japonicum.

Результаты практического использования препаратов микроб-ного происхождения для защиты растений от сорняков пока несравненно более скромные по сравнению с масштабами применения классических гербицидов. Однако микробные препа-раты открывают принципиально новые возможности с точки зрения охраны окружающей человека среды. Специалисты в области защиты растений считают, что в ближайшие годы производство гербицидов микробного происхождения, вырабатываемых на био-технологических предприятиях, резко возрастет. Ожидается, что свой вклад в развитие их производства внесет генетическая инженерия.

Источником получения гербицидов могут быть не только микроорганизмы, но и высшие растения. Дело в том, что они синтезируют самые разнообразные вещества, часть из которых через корни выделяется в почву. Среди корневых выделений растений имеются соединения, губительно влияющие на другие растения. Весьма интенсивным гербицидным, бактерицидным и фунгицидным действием обладает, например, агропирен, выделяе-мый в среду сорняком пыреем ползучим. Если из корневищ пырея отогнать эфирное масло, то оно будет содержать около 95 % агропирена. Установлено, что агропирен проникает в корни и листья растений и вызывает сначала повреждение кончиков корней, а затем отмирание корневой системы. Проникая в сосуды, он перемещается по растению и отравляет наиболее молодые части растений.

В настоящее время ученые исследуют коллекции сортов различных культур в отношении выделения ими веществ, угнетаю-щих сорную растительность. Сорта, обладающие такой способ-ностью, при выращивании не требуют внесения гербицидов.

В настоящее время методы генетической и клеточной инжене-рии все чаще начинают применяться для создания растений, устойчивых к болезням, вредителям и токсическим веществам. Так, например, с помощью плазмид опухолеобразующей бактерии Agrobacterium tumefaciens были получены устойчивые к антибиотику канамицину растения табака и томатов. Путем перенесения в клетки табака, сои, хлопчатника и томатов гена устойчивости к гербициду глифосату удалось повысить их резистентность к обра-ботке гербицидами. В растения табака был перенесен ген, контро-лирующий синтез токсичного для личинок насекомых белка В. thuringiensis. Ген, контролирующий образование токсичного для личинок белка, предварительно был клонирован и введен в кишеч-ную палочку. Благодаря повышению устойчивости табака по отно-шению к вредным насекомым удалось снизить уровень химической защиты его от насекомых.

Получение растений-регенерантов, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессовым факторам методами клеточной инжене-рии

Засуха. Недостаток воды в почве наносит значительно больший урон растениеводству, чем все остальные стрессовые факторы, вместе взятые. Засуха приводит к возникновению водного дефицита в почве и соответственно в растениях, вызывая у них водный стресс. Хотя термин «засуха» относится главным образом к почвенному водному стрессу, он включает также воздействие жары на растения. Стресс, вызванный вод-ным дефицитом, может быть первичным в случае засухи, а также вторич-ным при низкотемпературном, тепловом или солевом стрессах. Стресс, вызванный засухой, ведет к прямым или непрямым повреждениям расте-ний, которые обусловлены инактивацией ферментов, нарушением биохи-мических путей, накоплением токсических веществ, утечкой ионов, де-фицитом питания и другими причинами.

С целью имитации in vitro стрессового эффекта засухи могут приме-няться питательные среды, которые дополнены осмотически активными веществами, понижающими внешний водный потенциал. В качестве та-кого селективного агента, для селекции на устойчивость к засухе были использованы полиэтиленгликоль (ПЭГ), представляющий собой непро-никающее в клетку осмотически активное вещество. Первое сообщение о выделении клеточных линий табака, устойчивых к стрессу, индуцирован-ному ПЭГ, появилось в 1979 г. (Heyser, Nabors, 1979). Позже для селекции на засухоустойчивость Р. Брессан с соавт. использовал клеточные линии томата, которые подвергались водному стрессу при культивировании каллусной ткани в присутствии ПЭГ 6000 в концентрации 15 %. В резуль-тате опытов были отобраны устойчивые каллусные линии, однако устой-чивость быстро терялась при культивировании каллуса на среде без осмотика, что указывает на физиологическую природу адаптации. Тестирова-ние каллусных линий на рост в присутствии ПЭГ предложено для иденти-фикации выносливых к засухе генотипов сои. Анализ роста каллусных тканей десяти сортов сои на средах с 0,15, 20 % ПЭГ 8000 свидетельство-вал о корреляции засухоустойчивости у растений и толерантности к ПЭГ культивируемых клеток. Для получения адаптированных к водному стрессу клеточных линий также применялись среды, содержащие в каче-стве осмотика 99--880 мМ маннитол. Как и в предыдущем случае, осмо-тически адаптированные клетки обладали повышенной выносливостью к солевому стрессу.

Засоление. Одним из лимитирующих факторов сельскохозяй-ственной продуктивности является засоление почв. Около 900 млн. га всех земель нашей планеты имеют повышенное содержание солей, а ко-личество засоленных почв с каждым годом возрастает. Особую тревогу вызывает увеличение в почвах содержания солей, которое происходит в результате их искусственного орошения. Решение данной проблемы во многом зависит от разработки рациональных агротехнических приемов, правильной методологии орошения, использования для полива частично или полностью обессоленной воды. С развитием биотехнологии растений потенциально возможным является получение солевыносливых геноти-пов у важных сельскохозяйственных культур путем селекции на уровне соматических клеток, слияния протопластов или переноса генов при ис-пользовании техники рекомбинантных молекул ДНК.

Вредное действие засоления имеет комплексный характер и обуслов-лено как нарушением осмотического баланса клетки, так и прямым ток-сическим влиянием ионов натрия, хлора на физиологические и биохими-ческие процессы в клетке. Результатом такого действия может быть уменьшение тургора клетки, ингибирование функции мембран и актив-ности ферментов, подавление фотосинтеза, нехватки отдельных ионов из-за нарушения селективного транспорта ионов, использование значи-тельного количества энергии для поддержания толерантности. Основные типы реакций растений, возникающие в ответ на повышение концентра-ции солей во внешней среде.

Экспериментальные данные, полученные многими учеными, показы-вают, что клеточные механизмы выносливости к засолению являются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых растений и что се-лекция на клеточном уровне представляет реальную перспективу получе-ния устойчивых к засолению форм растений.

Большинство селекционных программ направлены на выделение in vitro клеточных линий, толерантных к присутствию в среде для культиви-рования клеток хлорида натрия. Так, показано, что выращивая гаплоид-ные каллусные клетки табака на среде с постоянно увеличивающейся концентрацией солей, получены клеточные линии, способные к росту в присутствии 1 % NaCl. M. Наборе с соав. предварительно обработав сус-пензионную культуру табака мутагеном (0,15 % ЭМС, 60 мин), путем од-ноступенчатой селекции выделили клеточные линии, устойчивые к 0,5 % NaCl. Отмечено, что выносливость, полученных регенерантов к засоле-нию, проявлялась на уровне целых растений.

На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сель-скохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева проводились исследо-вания по получению солеустойчивых растений на примере яровых твер-дых и мягких пшениц. Первичным эксплантом служили как изолирован-ные незрелые зародыши, так и гаплоиды. Клеточную селекцию проводили на каллусной ткани, культивируемой на питательной среде, содержащей 0,3 %NaCI или Na2SO4 в течение 5--6 пассажей. В результа-те исследований были получены устойчивые клеточные линии, а также растения-регенеранты. Тестирование на солеустойчивость первого се-менного поколения растении-регенерантов методом регистрации замед-ленной флоуроесценции показало, что фотосинтетический аппарат неко-торых растении-регенерантов по устойчивости к засолению превосходит исходный сорт (Никифорова И.Д., 1993, 1994).

Солевыносливость растений удается также повысить в результате се-лекции к одному фактору засоления осмотическому стрессу. Например, клетки томата, адаптированные к водному стрессу, индуцированному полиэтиленгликолем, обладали повышенной устойчивостью к NaС1. Повы-шенная толерантность к соли обнаружена у клеточных линий моркови, отобранных на среде, содержащей в качестве осмотика маннитол в высо-кой концентрации (99--870 мМ). Из этих результатов следует, что адап-тация клеток к осмотическому стрессу применима для отбора солевынос-ливых вариантов, а исследования подобного рода представляют интерес для изучения как во взаимодействии, так и независимо друг от друга.

Металлы. Присутствие в почве в большом количестве ионов ме-таллов, токсически влияющих на растения, или недостаток ионов, ис-пользуемых растениями в качестве питательных веществ, могут быть причиной ионного (минерального) стресса у растений. Особое внимание ученых привлекает изучение стрессов, обусловленных наличием в почве ионов тяжелых металлов, многие из которых токсически влияют как на растительные, так и на животные организмы. Стрессовое состояние у рас-тений может быть индуцировано ионами таких тяжелых металлов, как цинк, кадмий, медь, ртуть; они также довольно часто встречаются и в почвах, механизмы устойчивости к токсическим ионам могут исключать уменьшение проницаемости плазмалеммы, детоксикацию ионов в ре-зультате связывания с органическими веществами, компартментализацию в вакуолях, а также изменения структуры ферментов, которые явля-ются их мишенями.

Работы по клеточной селекции растений на устойчивость к ионным стрессам начаты недавно, но уже имеют положительный результат. Во всех экспериментах используется метод прямой селекции, при котором в качестве селективного агента применяли токсические концентрации со-лей. Однако создание стрессовых селективных условий in vitro, идентич-ных таковым в природе, крайне затруднительно. В природных условиях помимо токсического действия ионов накладываются другие факторы, в частности наличие различных веществ, кислотность почвы и т. д. Для се-лекции на клеточном уровне используют питательные среды, которые хотя не полностью соответствовали естественным стрессовым условиям, все же обеспечивали экспрессию признака устойчивости и давали воз-можность отбирать нужные варианты.

Путем прямой селекции in vitro отобраны клеточные линии петунии, устойчивые к ртути, сорго--к алюминию, моркови -- к алюминию и марганцу одновременно; суспензионные клеточные культуры дурма-на -- к кадмию. На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА также проводились работы по получению клеточных линий и рас-тений-регенерантов льна-долгунца, устойчивых к соли нитрата кадмия и изучалось действие этой соли на интактные растения. Экспериментально показано, что присутствие ионов кадмия в почве приводит к торможению роста стеблевой и корневой частей растения, к сокращению на 7--9 дней онтогенетических фаз развития, следующих за фазой «елочки» по сравне-нию с контролем, культурные виды накапливают ионы кадмия в вегета-тивной массе, в то время как дикие -- нет. Мезо- и ультраструктурный анализ стеблей льна-долгунца показал, что присутствие кадмия в суб-страте приводило к уменьшению количества клеток элементарных воло-конец в пучке, к некомпактному расположению клеток элементарных во-локонец в лубяных пучках, а также к формированию клеток элементар-ных волоконец неодинаковых размеров в пределах одного пучка и к раз-личным срокам формирования вторичной клеточной стенки. В результате клеточной селекции были получены растения-регенеранты, обладающие устойчивостью к соли кадмия (Гончарук Е.А., 2000).

Экстремальные температуры. Причиной стрессово-го фактора у растений могут быть относительно высокие или низкие тем-пературы. Работ по клеточной селекции на устойчивость к этим стрессам немного. В изученной нами литературе сведений о клеточной селекции к тепловому шоку не обнаружено, хотя белки теплового шока являются предметом пристального изучения биологов различного профиля. Что касается работ по клеточной селекции к низкотемпературным факторам, то они имеют место.

Холодовой стресс у растений может быть вызван температурами большого диапазона: от 10--15° до 0°С. Такому стрессу наиболее подвер-жены растения тропических и субтропических зон. Стойкость растений к охлаждению обусловлена способностью липидов мембран оставаться в жидком состоянии благодаря наличию большой пропорции ненасыщен-ных жирных кислот и/или повышенного содержания стеролов. Повреж-дения, вызванные промораживанием растений (температура ниже 0°С) связаны прежде всего с формированием внеклеточного льда. При этом отток воды во внеклеточное пространство приводит к вторичному эффек-ту, вызванному водным стрессом. Нарушения, вызываемые отрицатель-ными температурами, могут быть предотвращены аккумуляцией антифризных веществ, уменьшением количества несвязанной воды при обез-воживании и увеличением способности переохлаждаться. Большинство авторов отмечают, что у растений происходят глубокие превращения за-пасных питательных веществ, в частности, у морозоустойчивых древес-ных растений накопление большого количества жиров, а у менее устой-чивых -- Сахаров.

Первые эксперименты, в которых описана возможность использова-ния культивируемых растительных клеток для отбора выносливых к низ-ким температурам клеточных линий, опубликованы в 1976 г. (Dix, Street, 1976). Работы проводились на суспензионных культурах табака и перца, которые после высева на агаризованные среды подвергались в течение 21 дня соответственно температурам -- 3° и 4°С. Среди отобранных кло-нов обнаружены линии, стабильно сохраняющие повышенную холодо-устойчивость.

Основываясь на имеющихся в этой области исследований данных, од-нозначный ответ о применимости прямой селекции in vitro растений, вы-носливых к низкой температуре, давать пока рано. Несомненно, однако, что индукция in vitro генетического разнообразия найдет применение для отбора более выносливых вариантов.

Список литературы

1. Биотехнология - агропромышленному комплексу // В.И.Артамонов. - М.:Наука, 1989г. - 160 с.

2. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб/В.С.Шевелуха, Калашникова Е.А. и др.; Под ред. В.С.Шевелухи - 2-е изд. перераб. и доп. - М.: Высш. шк., 2003. -496.

Страницы: 1, 2, 3